Tình hình sản xuất và tiêu thụ
Tại Việt Nam, từ năm 2001, hoạt động xuất khẩu cá cảnh bắt đầu phát triển mạnh. Riêng năm 2004, kim ngạch xuất khẩu cá cảnh cả nước đã đạt gần 10 triệu USD. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), hiện nay hầu như các loài cá cảnh trên thế giới đều đã có ở nước ta với hơn 100 loài. Trong đó, cá dĩa và bảy màu là hai loài được ưa chuộng nhất. Thời điểm thị trường hút hàng, cá dĩa không đủ để xuất khẩu, đặc biệt lượng cá dĩa luôn chiếm phần lớn trong tổng lượng cá cảnh xuất khẩu.
Thực tế khi nuôi các loại cá cảnh, các sắc tố hiện diện trên da đóng một vai trò quan trọng đối với giá trị thương mại của cá. Màu sắc ở loài cá nói chung được quyết định bởi các tế bào sắc tố nằm ngay trên bề mặt da, phía dưới lớp vảy. Trong đó, các tế bào sắc tố đỏ và vàng hầu hết bị ảnh hưởng bởi chế độ dinh dưỡng. Do đó, cách tốt nhất là bổ sung các thực phẩm kích thích tạo màu để cải thiện và duy trì màu đẹp cho cá. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam, các loại thức ăn chế biến có bổ sung sắc tố như Carophyll Pink® 10% CWS (của hãng DSM, trước đây là Roche Vitamins) chứa 10% astaxanthin, là loại sắc tố giúp cá có màu sắc đẹp rực rỡ và tăng sức đề kháng nên có giá khá cao. Các loại thức ăn khác rất đa dạng về mẫu mã và chủng loại, nhưng đa số là do nước ngoài sản xuất, giá cả rất đắt, còn chất lượng, thành phần dinh dưỡng thì nằm ngoài tầm quản lý của các nhà chuyên môn.
Mặt khác, ngoài việc phòng bệnh cho cá trong quá trình nuôi ở các cơ sở sản xuất, việc xuất khẩu cá ra thị trường ngoài nước đòi hỏi cá thương phẩm phải có khả năng chống chịu cao, đặc biệt là đối với các stress môi trường gây ra do quá trình vận chuyển. Astaxanthin và β-glucan là hai hợp chất có khả năng đáp ứng các yêu cầu này nhưng hiện tại chưa có sản phẩm nào kết hợp hiệu quả cả hai thành phần để bổ sung vào thức ăn cho cá dĩa, đặc biệt là cá dĩa đỏ.
Astaxanthin chủ yếu được thu nhận từ Haematococcus pluvialis, từ nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), vi khuẩn Agrobacterium auraticum, ngoài ra còn được tổng hợp hóa học hoặc vỏ giáp xác,... Trong đó, vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp. là hai nguồn rất có tiềm năng để sản xuất astaxanthin nhằm nâng cao khả năng tích lũy astaxanthin và ly trích astaxanthin đạt hiệu suất cao, ứng dụng trong sản xuất, cụ thể là sản xuất chế phẩm bổ sung vào thức ăn cho cá dĩa đỏ.
β-glucan là một hợp chất có thể thay thế kháng sinh, tăng cường khả năng phòng ngừa dịch bệnh, kích thích hệ miễn dịch của cá. β-glucan được thu nhận phổ biến từ nấm men bởi nó là thành phần quan trọng cấu thành nên vách của tế bào nấm men. Nghiên cứu trên Saccharomyces cerevisiae cho thấy, β-glucan chiếm từ 50-57% trọng lượng vách tế bào. Saccharomyces cerevisiae (từ bã men bia - một phế phụ liệu tương đối dồi dào trong công nghiệp bia rượu, hoặc men bánh mì) cùng với Rhodosporidium sp. được xem là những chủng nấm men tiềm năng trong việc sản xuất β-glucan nhằm tăng hiệu quả kinh tế, giảm giá thành chế phẩm bổ sung vào thức ăn cá dĩa đỏ, góp phần giải quyết một số vấn đề về môi trường đang được đặt ra trong hiện tại.
Quy trình và phương pháp thực hiện
Quy trình nuôi cấy Rhodosporidium sp. trong hệ thống pilot 2 lít
Sơ đồ quy trình
Thuyết minh quy trình
Chủng Rhodosporidium sp. hoạt hóa trong môi trường Hansen, được nuôi lắc 200 vòng/phút trong 48 giờ. Lúc này tế bào đạt mật độ khoảng 10-14x106 tế bào/mL. Hút 10% giống từ môi trường Hansen cho vào môi trường rỉ đường (hệ thống pilot 2L) với các thông số môi trường nuôi cấy thích hợp (MgSO4.7H2O: 3 g/l, Urea: 0,5 g/l, hàm lượng đường tổng 25 g/l). Nuôi trong hệ thống pilot 2L trong 86 giờ, sau đó thu sinh khối. Sấy mẫu và bảo quản. Kết quả nuôi hệ thống pilot 2l ta thu nhận được trọng lượng sinh khối khô là 6,1696 g/l và hàm lượng astaxanthin là 2309,17 µg/l.
Quy trình nuôi cấy tảo Haematococcus pluvialis
Sơ đồ quy trình
Thuyết minh quy trình
Giai đoạn 1: lựa chọn môi trường tăng trưởng để đạt mật độ tế bào và sinh khối cực đại
Chủng Haematococcus pluvialis được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II. Chủng tảo được nuôi cấy trong môi trường RM dưới các điều kiện: nhiệt độ 25±3°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, chu kì chiếu sáng (sáng:tối) 12:12, có sục khí để đảo đều tảo. 200 ml tế bào H. pluvialis được bổ sung vào 2.000 ml môi trường BG-11 với mật độ ban đầu khoảng 4 x 106 tế bào/ml (tỷ lệ cấy giống 10%).
Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong các chai duran có ống dẫn khí vào và ra. Khí sau khi bơm vào được đi qua hệ thống lọc bụi và syring lọc khuẩn, cuối cùng đi vào môi trường nuôi tảo bằng các ống thủy tinh đã hấp khử trùng. Tiến hành sục khí để đảo đều tảo, nuôi cấy ở 25±3°C, dưới cường độ chiếu sáng 2.000 Lux bằng cách sử dụng hệ thống đèn LED và chu kỳ chiếu sáng (sáng:tối) là 12:12 giờ. Sau 14 ngày nuôi cấy, đánh giá sự tăng trưởng của vi tảo thông qua mật độ tế bào và lượng sinh khối tích lũy được cho thấy, mật độ tế bào đạt cao nhất khoảng 108 tế bào/ml tảo H. pluvialis. Sau đó được đem ly tâm thu sinh khối và chuyển sang môi trường RM thiếu hụt nitơ, phốt pho nhằm gây stress tích trữ astaxanthin.
Giai đoạn 2: stress nhằm tích lũy astaxanthin nhiều nhất
Vi tảo được nuôi trong môi trường BG-11 (giai đoạn 1), sau 14 ngày thì tiến hành ly tâm thu sinh khối tảo, mật độ tế bào khoảng 108 tế bào/ml, bổ sung vào 100ml môi trường RM thiếu hụt nitơ, phốt pho và được chiếu sáng liên tục 24 giờ/ngày nhằm gây stress liên tục trong 10 ngày, tế bào đã phát triển thành nang bào trưởng thành và hàm lượng astaxanthin tích đạt được chiếm 2,67% trọng lượng khô.
Quy trình chiết tách Astaxathin từ Rhodosporidium sp.
Sơ đồ quy trình
Thuyết minh quy trình
Cân 20g sinh khối khô nấm men Rhodosporidium sp. nghiền với bột thủy tinh trong 5 phút với tỷ lệ (1w:3w) tương ứng là 60g bột thủy tinh, sau đó ngâm với HCl 4.5N với tỷ lệ mẫu và acid là 1w:25v tương ứng 500ml HCl, ủ ở nhiệt độ 800C trong 20 phút, sau đó đem ngâm với dung môi acetone rồi đuổi dung môi thu được astaxanthin dạng sệt với hiệu suất tách chiết là 5,8821% tại độ ẩm nguyên liệu là 11,7429%.
Quy trình chiết tách Astaxathin từ vi tảo Haematococcus pluvialis
Sơ đồ quy trình
Thuyết minh quy trình
+ Tách chiết bằng bột thủy tinh – HCl – acetone:
Nghiền 10g sinh khối tảo khô với 100g bột thủy tinh, rồi xử lý với 2 lít HCl 4N ở 70°C trong 10 phút. Mẫu được làm lạnh và ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, mẫu được rửa hai lần bằng nước cất và huyền phù với 500ml acetone trong 1 giờ, phần mẫu chiết này được ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi (chiết 2-3 lần đến khi phần cặn hết sắc tố). Đuổi hết các dung môi thu được astaxanthin dạng sệt. Lưu ý quá trình tách chiết được thực hiện nơi ít ánh sáng.
+ Tách chiết bằng bột thủy tinh - DMSO – acetone:
Nghiền 10g sinh khối tảo khô với 100g bột thủy tinh, rồi ủ với 200ml DMSO ở 70°C trong 10 phút. Ly tâm 5.000 vòng/phút 5 phút, thu dịch nổi chứa DMSO. Thêm vào 50 ml acetone, nghiền kỹ ly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi (chiết nhiều lần đến khi dịch không còn sắc tố). Đuổi hết các dung môi thu được astaxanthin dạng sệt. Lưu ý quá trình tách chiết được thực hiện nơi ít ánh sáng.
Quy trình tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men Rhodosporidium sp.
Sơ đồ quy trình
Thuyết minh quy trình
+ Nguyên tắc:
Bản chất β-glucan là một polysaccharide, do đó phương pháp tách chiết β-glucan cũng dựa trên nguyên lý chung khi tách chiết polysaccharide. Sử dụng sodium hydroxide (NaOH) để tách chiết β-glucan, sau đó tiến hành ly tâm thu hồi và tinh chế. Phương pháp hóa học thích hợp với các mẫu phân tích chứa một lượng glucan tổng số lớn hơn 20%. Theo nghiên cứu của Mỹ, các phương pháp này đạt hiệu suất thu hồi 50-80%, quy trình đơn giản, không tốn kém nhiều thời gian và chi phí như đối với phương pháp sử dụng enzyme β-1,3-glucanase.
+ Bước 1: ly giải thành tế bào nấm men. Trong dung dịch NaOH 4%, tỷ lệ mẫu:NaOH là 1w:10v ở nhiệt độ 50oC, trong 9 giờ. Sau đó ly tâm rửa với ethanol đến khi hết màu. Khi kết thúc bước ly giải, một lượng β-glucan cũng được phóng thích ra dịch nổi, nên ký hiệu đó là POLY2, và được thu nhận bằng cách tủa bằng ethanol (cồn) để tận thu.
+ Bước 2: tách polysaccharide từ thành tế bào: NaOH 0.5M, thời gian 4 giờ, tỷ lệ mẫu:NaOH là 1:5, nhiệt độ 1000C thu được POLY1.
+ Bước 3: sau khi ly trích polysaccharide tiến hành các bước tinh sạch loại tạp chất, khử màu và trung hòa mẫu.
Hiệu suất của quy trình: hàm lượng β-glucan tính trên khối lượng sinh khối khô nấm men mẫu POLY1, POLY2 lần lượt là 9,31%, 0,69% (g/g) và hàm lượng β-glucan là 64,87% và 18,18% (w/w).
Quy trình tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men bia và nấm men bánh mì
Sơ đồ quy trình
Thuyết minh quy trình
PL 1: polysaccharide sau khi ly trích từ vách tế bào men bia.
PL 2: polysaccharide của dịch sau khi ly giải tế bào nấm men bia.
PL 3: polysaccharide sau khi ly trích từ vách tế bào men bánh mì.
PL 4: polysaccharide của dịch sau khi ly giải tế bào men bánh mì.
+ Tế bào nấm men bia và men bánh mì được rửa 3 lần với dung dịch muối ăn 5% để loại hết những tạp chất, đường, protein. Sau đó sấy khô đến độ ẩm dưới 10% ở nhiệt độ 800C. Chế phẩm sấy khô được lưu trữ đến khi sử dụng cho tách chiết, thu nhận β-glucan.
+ Tách chiết thu nhận β-glucan bằng cách cho tế bào nấm men ly giải đối với nấm men bằng cách cho dung dịch NaOH 4% vào tế bào nấm men với tỉ lệ 10 w(g):1 v(ml) khuấy đều ở 500C (tế bào nấm men bắt đầu li giải), thời gian với nấm men bia và men bánh mì lần lượt là 22 giờ và 21 giờ để thu nhận polysaccharide vách tế bào nấm men. Ly tâm thu tủa. Dịch nổi được tủa với ethanol 96% với tỷ lệ 1v:4v để tận thu PL 2 và PL 4. Tủa thu được tiến hành ly trích β-glucan (PL 1 và PL 3) bằng cách đun vách tế bào nấm men bia hoặc nấm men bánh mì với NaOH 1M ở 1000C trong 4 giờ, tỉ lệ vách tế bào (g) và NaOH 1M (ml) là 1w:5v. Sau đó li tâm ở 4.000 vòng/phút trong 10 phút thu tủa là sản phẩm β-glucan. Chế phẩm được đem sấy khô đến độ ẩm nhỏ hơn 10%.
Ưu điểm của công nghệ, hiệu quả kinh tế
Quy trìnhcho phép tạo ra chế phẩm chứa astaxanthin (từ nấm men Rhodosporidium sp. và vi tảo Haematococcus pluvialis) và β-glucan (từ Rhodosporidium sp. và Saccharomyces cerevisiae) bổ sung vào thực phẩm chăn nuôi, nâng cao phẩm chất vật nuôi.
Cụ thể, kết quả sau 3 tháng sử dụng chế phẩm astaxanthin và 1 tháng sử dụng chế phẩm β-glucan cho thấy, việc bổ sung astaxanthin và β-glucan lần lượt 90mg/kg thức ăn và 10g/kg thức ăn có thể làm đậm màu của cá và làm tăng hệ miễn dịch (tăng tổng số tế bào bạch cầu ở cá). So sánh với chế phẩm astaxanthin thương mại trên thị trường cho thấy, chế phẩm astaxanthin tách chiết từ quy trình có chất lượng (26,23 điểm) tương đương chế phẩm thương mại (28,25 điểm), chế phẩm không sử dụng astaxanthin cho kết quả màu sắc trên da cá dĩa nhạt nhất với 20,48 điểm. Từ đây có thể tạo ra chế phẩm hỗn hợp chứa cả hai chất astaxanthin và β-glucan để bổ sung vào thức ăn cho cá dĩa, vừa làm tăng màu sắc đẹp một cách an toàn, vừa tăng sức đề kháng cho cá, từ đó tăng được giá trị kinh tế của cá.
Thông tin liên hệ chuyên gia, hỗ trợ
1. PGS. TS. Ngô Đại Nghiệp
ĐT: 0908 283 498. Email: ndnghiep@hcmus.edu.vn
2. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM
Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, P.4, Q.5, TP.HCM.